平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离得到单个细胞繁殖的菌落。在操作过程中要注意每次划线后，都要灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

A、每个区域划线前后都要对接种环进行灭菌，划线完成后培养基不需灭菌，A错误；

B、划线操作时要左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，B错误；

C、从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连，C错误；

D、划线时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的，D正确。

故选D。