基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因−−DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA−−分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质−−抗原−抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）以mRNA为模板反转录形成cDNA；扩增目的基因可采用PCR技术。

（2）根据图1中碱基序列和图2中四种限制酶的识别序列可知，选用图1中的两种名称分别为XhoI、EoRI的限制酶将“pIRES2−EGFP质粒”载体进行双切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。

（3）根据第（2）题可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此培养基中需要加入卡那霉素。

（4）将扩增后的“pIRES2−EGFP载体/PD−1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后，为确定PD−1基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有PD−1蛋白。为判断其是否具有生物学活性和功能，则可裂解293T细胞，提取该物质看能否与PDL−1发生结合，从而阻断“PD−1与PDL−1信号通路”。研究中还会有一步骤，只将“pIRES2−EGFP载体”转入293T细胞，其目的是作为对照。